標簽： 實時 熒光定量PCR realtime PCR  本生生物

所謂實時熒光定量 PCR 技術，是指在 PCR 反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個 PCR 進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

原理及材料：

實驗材料：細胞樣品
試劑、試劑盒：RNA 提取試劑盒 熒光定量 PCR  MixTRIZOL dNTP lf 仿 逆轉錄酶 MMLV ybc Taq 酶 DEPC 水 ddH2O TE MgCl2 瓊脂糖 溴化乙錠 MOPS jiaquan 乙酸鈉 EDTA EB 溴酚蘭    
儀器、耗材：離心管 離心機 風光光度計 電泳槽 凝膠板 Realtime PCR 儀

實驗步驟:

一、 樣品 RNA 的抽提

1.  取凍存已裂解的細胞，室溫放置 5 分鐘使其溶解。

2.  兩相分離 每 1 ml 的 TRIZOL 試劑裂解的樣品中加入 0.2 ml 的 lf，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體 15 秒后，15 到 30℃孵育 2 到 3 分鐘。4℃下 12 000 rpm 離心 15 分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚 lf 相，中間層以及無色水相上層。RNA 全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的 TRIZOL 試劑的 60%。

3.  RNA 沉淀 將水相上層轉移到一干凈無 RNA 酶的離心管中。加等體積 ybc 混合以沉淀其中的 RNA，混勻后 15 到 30℃孵育 10 分鐘后，于 4℃下 12 000 rpm 離心 10 分鐘。此時離心前不可見的 RNA 沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。

4.  RNA 清洗 移去上清液，每 1 mlTRIZOL 試劑裂解的樣品中加入至少 1 ml 的 75% 乙醇（75% 乙醇用 DEPCH2O 配制），清洗 RNA 沉淀。混勻后，4℃下 7 000 rpm 離心 5 分鐘。

5.  RNA 干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使 RNA 沉淀在室溫空氣中干燥 5-10 分鐘。

6.  溶解 RNA 沉淀 溶解 RNA 時，先加入無 RNA 酶的水 40μl 用槍反復吹打幾次，使其溶解，獲得的 RNA 溶液保存于 - 80℃待用。

二、 RNA 質量檢測

1.  紫外吸收法測定

先用稀釋用的 TE 溶液將分光光度計調零。然后取少量 RNA 溶液用 TE 稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計 260nm 和 280nm 處的吸收值，測定 RNA 溶液 濃度和純度。

（1）濃度測定

A260 下讀值為 1 表示 40 μg RNA/ml。樣品 RNA 濃度 (μg/ml) 計算公式為：A260 × 稀釋倍數 × 40 μg/ml。具體計算如下：
RNA 溶于 40 μl DEPC 水中，取 5 μl，1:100 稀釋至 495 μl 的 TE 中，測得 A260 = 0.21
RNA 濃度 = 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl
取 5 ul 用來測量以后，剩余樣品 RNA 為 35 μl，剩余 RNA 總量為：
35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg

（2）純度檢測

RNA 溶液的 A260/A280 的比值即為 RNA 純度，比值范圍 1.8 到 2.1。

2.  變性瓊脂糖凝膠電泳測定

（1）制膠

1 g 瓊脂糖溶于 72 ml 水中，冷卻至 60℃，10 ml 的 10× MOPS 電泳緩沖液和 18 ml 的 37% jq 溶液 (12.3 M)。
10×MOPS 電泳緩沖液
濃度  成分
0.4 M  MOPS，pH 7.0
0.1 M  乙酸鈉
0.01 M  EDTA

灌制凝膠板，預留加樣孔至少可以加入 25 μl 溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內，加足量的 1×MOPS 電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。

（2）準備 RNA 樣品

取 3 μgRNA，加 3 倍體積的 jq 上樣染液，加 EB 于 jq 上樣染液中至終濃度為 10 μg/ml。加熱至 70℃孵育 15 分鐘使樣品變性。

（3）電泳

上樣前凝膠須預電泳 5 min，隨后將樣品加入上樣孔。5-6 V/cm 電壓下 2 h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少 2-3 cm。

（4）紫外透射光下觀察并拍照

28S 和 18S 核糖體 RNA 的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提 RNA 的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的 2 倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的 RNA（tRNA 和 5S 核糖體 RNA）組成。在 18S 和 28S 核糖體帶之間可以看到一片彌散的 EB 染色物質，可能是由 mRNA 和其它異型 RNA 組成。RNA 制備過程中如果出現 DNA 污染，將會在 28S 核糖體 RNA 帶的上面出現，即更高分子量的彌散遷移物質或者帶，RNA 的降解表現為核糖體 RNA 帶的彌散。用數碼照相機拍下電泳結果。

三、樣品 cDNA 合成

1.  反應體系

序號          反應物           劑量

1          逆轉錄 buffer       2 μl

2         上游引物              0.2 μl

3         下游引物              0.2 μl

4          dNTP                   0.1 μl
5       逆轉錄酶 MMLV     0.5 μl
6         DEPC 水              5 μl
7          RNA 模版            2 μl
8           總體積               10 μl

輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm 短暫離心。

2.  混合液在加入逆轉錄酶 MMLV 之前先 70℃干浴 3 分鐘，取出后立即冰水浴至管內外溫度一致，然后加逆轉錄酶 0.5 μl，37℃水浴 60 分鐘。

3.  取出后立即 95℃干浴 3 分鐘，得到逆轉錄終溶液即為 cDNA 溶液，保存于 - 80℃待用。

四、 梯度稀釋的標準品及待測樣品的管家基因（β-actin）實時定量 PCR

1.  β-actin 陽性模板的標準梯度制備 陽性模板的濃度為 1011，反應前取 3 μl 按 10 倍稀釋（加水 27 μl 并充分混勻）為 1010，依次稀釋至 109、108、107、106、105、104，以備用。

2.  反應體系如下：

標準品反應體系

序號           反應物                           劑量
1       SYBR Green 1 染料             10 μl
2       陽性模板上游引物 F              0.5 μl
3      陽性模板下游引物 R              0.5 μl
4                dNTP                            0.5 μl
5                 Taq 酶                           1 μl
6           陽性模板 DNA                    5 μl
7              ddH2O                            32.5 μl
8               總體積                            50 μl

輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm 短暫離心。

3.  管家基因反應體系：

序號            反應物                                劑量
1      SYBR Green 1 染料                   10 μl
2      內參照上游引物 F                         0.5 μl
3     內參照下游引物 R                         0.5 μl
4               dNTP                                    0.5 μl
5               Taq 酶                                   1 μl
6      待測樣品 cDNA                             5 μl
7              ddH2O                                  32.5 μl
8             總體積                                    50 μl

輕彈管底將溶液混合， 6000 rpm 短暫離心。

3.  制備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機，反應條件為：93℃ 2 分鐘，然后 93℃ 1 分鐘，55℃ 2 分鐘，共 40 個循環。

五、 制備用于繪制梯度稀釋標準曲線的 DNA 模板

1.  針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的 cDNA 模板進行 PCR 反應。

2.  反應體系

序號                     反應物                        劑量
1                     10× PCR 緩沖液            2.5 ul
2                           MgCl2 溶液              1.5 ul
3                           上游引物 F                 0.5 ul
4                           下游引物 R                0.5 ul
5                            dNTP 混合液            3 ul
6                            Taq 聚合酶               1 ul
7                             cDNA                       1 ul
8                    加水至總體積為               25 ul

輕彈管底將溶液混合，6000rpm 短暫離心。

35 個 PCR 循環（94℃1 分鐘；55℃1 分鐘；72℃1 分鐘）； 72?C 延伸 5 分鐘。

（3）PCR 產物與 DNA Ladder 在 2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測 PCR 產物是否為單一特異性擴增條帶。

（4）將 PCR 產物進行 10 倍梯度稀釋：將 PCR 產物進行 10 倍梯度稀釋：設定 PCR 產物濃度為 1×1010，依次稀釋至 109、108、107、106、105、104 幾個濃度梯度。

六、 待測樣品的待測基因實時定量 PCR

1.  所有 cDNA 樣品分別配置實時定量 PCR 反應體系。

2.  體系配置如下：

序號             反應物                                劑量
1            SYBR Green 1 染料               10 ul
2                上游引物                               1 ul
3                下游引物                               1 ul
4                  dNTP                                   1 ul
5              Taq 聚合酶                               2 ul
6             待測樣品 cDNA                        5 ul
7                   ddH2O                              30 ul
8                   總體積                               50 ul

輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm 短暫離心。

（3）將配制好的 PCR 反應溶液置于 Realtime PCR 儀上進行 PCR 擴增反應。反應條件為：93℃ 2 分鐘預變性，然后按 93℃ 1 分鐘，55℃1 分鐘，72℃1 分鐘，共 40 做個循環，最后 72℃7 分鐘延伸。

七、 實時定量 PCR 使用引物列表

引物設計軟件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補；引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構；引物不在模板的非目的位點引發 DNA 聚合反應 (即錯配)。

八、電泳

各樣品的目的基因和管家基因分別進行 Realtime PCR 反應。PCR 產物與 DNA Ladder 在 2％瓊脂糖凝膠電泳，GoldView 染色，檢測 PCR 產物是否為單一特異性擴增條帶。

注：僅供參考！