ELISA操作指南：從板子準(zhǔn)備到結(jié)果分析

　　以下是ELISA實(shí)驗(yàn)從板子準(zhǔn)備到結(jié)果分析的完整操作指南，結(jié)合高可信度來(lái)源和富媒體資源整理：

　　一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

　　試劑與耗材?

　　需準(zhǔn)備包被板、標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化抗體、酶標(biāo)二抗、TMB顯色液及終止液等?

　　試劑需室溫平衡1小時(shí)，凍存樣本需4℃緩慢解凍?

　　樣本處理?

　　血清/血漿需3000×g離心15分鐘去除纖維蛋白，細(xì)胞上清需0.22μm過(guò)濾?

　　建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳稀釋比例(通常5-10倍梯度稀釋)?

　　二、實(shí)驗(yàn)操作流程

　　包板與封閉?

　　用碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)稀釋抗原/抗體(1-10 μg/mL)，每孔加100μL，4℃過(guò)夜或37℃孵育2小時(shí)?

　　封閉液推薦5% BSA或脫脂奶粉，室溫孵育1-2小時(shí)?

　　加樣與孵育?

　　標(biāo)準(zhǔn)品需2倍稀釋系列(如640pg/ml至0pg/ml)，每濃度設(shè)2個(gè)復(fù)孔

　　樣本與標(biāo)準(zhǔn)品加樣需在15分鐘內(nèi)完成，37℃孵育30-60分鐘?

　　洗滌關(guān)鍵步驟?

　　每孔加300μL洗滌液，震蕩浸泡1-2分鐘，重復(fù)3-5次，拍干時(shí)避免液體殘留?

　　三、顯色與讀數(shù)

　　顯色反應(yīng)?

　　每孔加100μL TMB底物，避光孵育5-30分鐘(顯色梯度需肉眼觀察)?

　　終止液(如2M硫酸)加入后15分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)450nm吸光值?

　　結(jié)果分析?

　　標(biāo)準(zhǔn)曲線需R2>0.99，樣本OD值需在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)?

　　陽(yáng)性判定：樣本OD值>陰性對(duì)照2.1倍?

　　常見(jiàn)問(wèn)題處理

　　高背景?：可能因洗滌不充分或封閉不足，需增加洗滌次數(shù)或更換封閉液?

　　顯色異常?：檢查底物有效期或孵育時(shí)間，避免氣泡干擾?

　　注：以上僅供參考，不作為實(shí)際數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)需嚴(yán)格遵循說(shuō)明或咨詢技術(shù)老師。

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